1、收集樣品
2、相關(guān)試劑 總rna提取試劑trezol reagent (rna提取試劑), m-mlv(cdna逆轉(zhuǎn)錄酶), rna 純化試劑, realqpcr mastermix (熒光定量pcr預(yù)混試劑)。
3、實驗儀器 熒光定量pcr儀; pcr儀;低溫離心機。
4、總rna提取
5、cdna合成 在0.5ml的離心管中加入1µl模板總rna(1µg/µl); 2µl隨機引物(t18, 10pmol/ul);2µl 10mm dntp mix;加水至15µl體系?；靹蚝?0℃變性rna 5分鐘，冰上速冷1分鐘，離心將溶液收集至管底加入6µl 5×pcr buffer;1µl rnaseout;1µl m-mlv rt;加水至30µl體系。pcr儀中反應(yīng)條件設(shè)置 37℃延伸60min，70℃保溫15min終止反應(yīng)。合成好的cdna置于 -20 ℃保存?zhèn)溆谩?br>6、引物設(shè)計與thermal cycler protocol thermal cycler protocol合成
7、實時定量pcr 按以下反應(yīng)體系進(jìn)行: 2x realqpcr mastermix(modified dna polymerase、sybr green i、optimized pcr buffer、5mm mgci2、dntp mix including dutp)25ul;上游引物f 1 ul，下游引物r 1 ul;cdna template 2ul。定量pcr儀擴增反應(yīng)條件設(shè)置:50 ℃ 2min ;95 ℃ 10min ;95℃ 15s --60 ℃ 60 s (40個循環(huán))。
8、pcr產(chǎn)物溶解曲線分析 將所擴增的pcr 產(chǎn)物進(jìn)行溶解曲線分析，單峰溶解曲線表示擴增產(chǎn)物單一，無非特異性擴增產(chǎn)物。溶解曲線生成的反應(yīng)程序為: 95 ℃ 15s , 60 ℃ 15 s , 95 ℃ 15s。
注意事項：收集標(biāo)本前必須清楚要檢測的成份是否足夠穩(wěn)定，對收集后當(dāng)天進(jìn)行檢測的標(biāo)本，儲存在4℃?zhèn)溆?，如有特殊原因需要周期收集?biāo)本，將標(biāo)本及時分裝后放在-20℃或-70℃條件下保存。避免反復(fù)凍融，標(biāo)本2-8℃可保存48小時，-20℃可保存1個月，-70度可保存6個月，部分標(biāo)本需添加抑肽酶。