pcr的概念:
pcr，即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，pcr），主要由高溫變性、低溫退火和適溫延伸三個(gè)步驟反復(fù)的熱循環(huán)構(gòu)成：即模板dna先經(jīng)高溫變性為單鏈，在dna聚合酶和適宜的溫度下，兩條引物分別與兩條模板dna鏈上的一段互補(bǔ)序列發(fā)生退火，接著在dna聚合酶的催化下以四種脫氧核苷酸三磷酸（dntps）為底物，使退火引物得以延伸，如此反復(fù)，使位于兩段已知序列之間的dna丨片段呈幾何倍數(shù)擴(kuò)增。
pcr的分類:
pcr有很多種，核心就是用引物擴(kuò)增特定的dna，以指數(shù)方式倍增的dna達(dá)到可以觀察到的量后，通過(guò)不同的觀察方法比較dna相對(duì)表達(dá)的高低。根據(jù)檢測(cè)方式的不同，分為終點(diǎn)pcr（也即常規(guī)pcr）和實(shí)時(shí)熒光定量pcr（quantitative real-time pcr，qpcr）,根據(jù)樣本類型的不同，還包括以rna為模板的反轉(zhuǎn)錄pcr（reverse transcription pcr，rt-pcr）。
終點(diǎn)pcr，顧名思義既是對(duì)pcr擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行定性及定量分析，在反應(yīng)過(guò)程中無(wú)法監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)行情況，只有反應(yīng)完成后通過(guò)跑膠得到結(jié)果。
1.熱啟動(dòng)pcr（hot start pcr）
在傳統(tǒng)的pcr反應(yīng)中，反應(yīng)體系各成分（taq dna聚合酶、dntp 和引物等）均是一次加入并進(jìn)入循環(huán)，在反應(yīng)溫度由室溫（25℃）上升至高溫（94～95℃）過(guò)程中，可能發(fā)生引物錯(cuò)配和二聚體的形成。引物與模板中一些非靶位點(diǎn)的錯(cuò)配和引物之間形成的二聚體，在taq酶的作用下均可延伸，這些非特異性產(chǎn)物又可以在后面的pcr循環(huán)中繼續(xù)擴(kuò)增，使非特異性產(chǎn)物不斷積累，同時(shí)，也消耗反應(yīng)體系的各成分，最終pcr擴(kuò)增的特異性產(chǎn)物大大減少。熱啟動(dòng)pcr(hot start pcr)是指dna聚合酶只有在樣品溫度至少超過(guò)70℃時(shí)才發(fā)揮作用的pcr。通過(guò)這種方式控制pcr反應(yīng)的必須組分dna聚合酶，直到反應(yīng)混合物被加熱到可以阻止非特異引導(dǎo)和引物聚合的溫度后，再啟動(dòng)pcr達(dá)到有效擴(kuò)增特異性pcr產(chǎn)物的目的。
ung酶通常和熱啟taq酶一同用于建立含有ung/dutp防污染體系的熱啟動(dòng)pcr反應(yīng)系統(tǒng)。
ung酶(uracil-n-glycosylase，尿嘧啶-n-糖基化酶)的作用原理是選擇性水解斷裂含有du的雙鏈或單鏈dna中的尿嘧啶糖苷鍵，形成的有缺失堿基的dna鏈在堿性介質(zhì)以及高溫下會(huì)進(jìn)一步水解斷裂，從而被消除。ung酶的最佳活性溫度為50℃，95℃滅活。作用：為保證pcr結(jié)果的準(zhǔn)確性，要預(yù)防非特異性pcr擴(kuò)增和污染。常用的措施是使用ung酶（uracil-n-glycosylase）和taq 酶熱啟動(dòng)。pcr反應(yīng)常見(jiàn)，最重要的污染物是pcr產(chǎn)物，防污染熱啟動(dòng)pcr試劑盒以dutp取代dttp，所以pcr產(chǎn)物都是含有du的dna鏈。在pcr開(kāi)始前增加50℃的保溫步驟，ung酶即可將反應(yīng)體系中已有的u-dna污染物中的尿嘧啶堿基降解，并在隨后變性這步的條件下dna鏈斷裂，消除由于污染dna產(chǎn)生的擴(kuò)增，從而保證擴(kuò)增結(jié)果的特異性，準(zhǔn)確性。
2.高保真pcr
taq酶具有5'-3'dna聚合酶活性和5'→3'的外切酶活性，缺少3'→5'的外切酶活性，但沒(méi)有從3'→5'方向外切酶的活性，擴(kuò)增得到的pcr產(chǎn)物的3'末端附有一個(gè)“a”堿基，可直接用于ta克隆，但是由于不具有3'→5'外切酶活性，因而在合成中對(duì)某些單核苷酸錯(cuò)配沒(méi)有校正功能。dna聚合酶的校正能力決定了保真度，會(huì)影響dna序列復(fù)制的準(zhǔn)確性。solis biodyne提供的blend mix同時(shí)包含taq酶和校正酶，使得pcr反應(yīng)既具有5'→3'方向合成dna的功能，又具有3'→5'方向外切酶的活性和糾錯(cuò)功能。
3.多重pcr
多重pcr是指在同一pcr反應(yīng)體系里加上二對(duì)以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的 pcr反應(yīng)。多重pcr不僅意味著節(jié)省時(shí)間、試劑和樣品，還能夠同時(shí)對(duì)比多個(gè)擴(kuò)增子。
在多重pcr中，因無(wú)法僅針對(duì)一個(gè)引物對(duì)或目的片段進(jìn)行反應(yīng)優(yōu)化，而是要考慮到所有引物和靶標(biāo)，所以可能會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增和效率降低。因此，為盡量減少由非特異性擴(kuò)增導(dǎo)致的錯(cuò)配，應(yīng)對(duì)引物進(jìn)行精心設(shè)計(jì)。首先，引物序列應(yīng)盡可能與其目的序列一一對(duì)應(yīng)，并且所有引物的 tm相差不應(yīng)超過(guò)5°c。其次，在多重pcr開(kāi)始前，應(yīng)利用單個(gè)pcr反應(yīng)驗(yàn)證每個(gè)引物對(duì)的特異性和擴(kuò)增效率。此外，擴(kuò)增子應(yīng)具有不同的大小，從而能夠通過(guò)凝膠電泳對(duì)其進(jìn)行分離鑒定。
4.長(zhǎng)片段pcr
常規(guī)pcr反應(yīng)可以擴(kuò)增到3~4kb的dna丨片段，而超過(guò)5kb的dna丨片段就已經(jīng)很難擴(kuò)增出來(lái)了。長(zhǎng)片段pcr即是指擴(kuò)增大于5kb的dna丨片段。ncbi推薦的基因克隆供應(yīng)商genecopoeia可提供長(zhǎng)片段pcr試劑盒，可擴(kuò)增18kb人來(lái)源gdna以及30kb λ噬菌體dna為模板等大片段dna，同時(shí)可擴(kuò)增高gc%片段，適用范圍廣，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中僅需添加引物與模板，操作簡(jiǎn)便。
5.高gc含量pcr
在dna（a、t、c、g）4種堿基中，鳥(niǎo)嘌呤（g）和胞嘧啶（c）所占的比率稱為gc含量。因?yàn)間、c之間形成三對(duì)氫鍵，解鏈所需能量較高，所以模板很難打開(kāi)，高gc含量（g+c≥60%）模板擴(kuò)增中所面臨的主要困難是模板中容易形成穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)妨礙dna聚合酶在模板上的推進(jìn)，而且模板上可能存在多個(gè)非特異性的引物復(fù)性位點(diǎn)，導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，甚至很多時(shí)候擴(kuò)增不出靶基因。solis biodyne可專業(yè)提供專業(yè)的高gc含量模板的pcr增強(qiáng)劑和預(yù)混液，可適用于gc含量高至79%的模板，輕松解決高gc含量pcr的難題。