近年來，crispr/cas9 基因編輯技術正在給整個科研界帶來革命性變化，該技術使用 crispr 系統(tǒng)將 cas9 蛋白和向導 rna 注入小鼠受精卵，就能輕松實現(xiàn)基因敲除，同時，注入 donor dna 則可實現(xiàn)基因敲入，甚至學術期刊 genome biology 有文章指出這項新技術將很快取代使用胚胎干細胞的基因修飾，看起來小鼠胚胎干細胞基因修飾技術的終結不可避免。
然而，事實是這樣嗎？
脫靶效應仍存爭議
crispr/cas9 這一被稱為 “魔剪” 的基因編輯工具在基因工程應用方面被寄予厚望。但是，脫靶效應這一有爭議的老問題一直影響著 crispr/cas9 系統(tǒng)的應用。有文獻報道，crispr/cas9 的切割是通過 grna 與基因組位置之間 20bp 堿基的配對，且配對堿基的 5′ 端需要有 pam 結構，再引導 cas9 作用實現(xiàn)的，但是 crispr/cas9 與靶位點識別的特異性主要依賴于 grna 與靠近 pam 處 10-12bp 堿基的配對，而其余遠離 pam 處 8-10bp 堿基的錯配對靶位點的識別影響不明顯，這項研究直接說明了 crispr/cas9 存在嚴重的脫靶性，即該技術可以發(fā)生非特異性切割，引起基因組非靶向位點的突變，這樣會造成研究結果的不確定性。
去年在 nature methods 雜志上發(fā)表的研究 “unexpected mutations after crispr-cas9 editing in vivo” 通過全基因組測序分析表明 crispr 基因編輯會引入數(shù)百種不可預估的突變到基因組中，文章所指出的大規(guī)模脫靶問題，對 crispr 的應用提出了尖銳的挑戰(zhàn)，卻又在今年 3 月 30 日出現(xiàn)反轉并進行了撤稿處理。值得注意的是，這篇文章的作者 kellie a schaefer 和共同作者 wen-hsuan wu 均同意撤稿，而包括通訊作者 alexander g bassuk 以及 vinit b mahajan 在內(nèi)的其余四位作者則不同意撤稿。這與通常的撤稿情況還是有所不同，一般的撤稿大多數(shù)情況貌似都是通訊作者要撤稿，這篇爭議性文章通訊作者則堅持了自己的意見。顯然，這篇文章在研究者們內(nèi)部也有巨大分歧。
不過，也有研究表明，crispr 的脫靶問題并沒那么嚴重：biorxiv 期刊上的研究 “whole genome sequencing of multiple crispr-edited mouse lines suggests no excess mutations.” 指出，多個采用 crispr/cas9 技術基因編輯的小鼠品系經(jīng)過全基因組測序后的結果顯示，crispr/cas9 技術可在生物水平上地對基因組進行編輯，并沒有引入很多非預期的脫靶突變。
從以上這些充滿爭議性的研究可以看出，在應用 crispr/cas9 技術時，其脫靶效應仍需謹慎考慮。綜合來看，現(xiàn)階段修飾準確、效果穩(wěn)定、脫靶率極低的 es 打靶技術仍是研究者的較優(yōu)選擇。
crispr/cas9 技術目前難以勝任復雜的基因編輯
另一方面，對于復雜的基因修飾（如條件性敲除、條件性點突變和大片段敲入等），crispr 有先天不足，因為此時需要 donor dna 與受精卵中基因組的特定位置發(fā)生同源重組，而同源重組的效率很低。相反，es 打靶技術在這一方面因其 flox 區(qū)域范圍大、對于復雜結構寬容度高、打靶一次成功率高等特點，會有明顯的優(yōu)勢。
crispr/cas9 專li之爭仍存爭議，商業(yè)化應用存在較大隱患
對于 crispr/cas9 技術，還有一個值得關注的是其專li使用問題，crispr/cas9 專li是基于多家機構的研究成果，產(chǎn)權不明晰，一直存在所有權之爭。
2017 年初，broad 研究所和合作者們被授權了關于真核生物細胞（包括人類細胞）的基因組編輯的 crispr 專li，而加州大學伯克利分校和合作者授權的專li是關于將 crispr 技術用于到 cell-free 系統(tǒng)中，并不是涉及真核細胞的基因組編輯。然而，后者對這一判決結果并不滿意，不滿意的結果就是啟動專li抵觸程序（interference proceeding）。通過該程序一個可以接手另一個的專li。
來自咨詢公司 ipstudies2017 年的數(shù)據(jù)顯示，目前還有 763 項和 cas9 相關的專li，在這些專li中，有些聲稱擁有某些 crispr/cas9 基因編輯方面的專li權，隨著時間過去，這些專li的擁有者或許也會試圖去維護他們的權利。
crispr 專li的紛爭給一些商業(yè)機構帶來了巨大的困惑。 首先，這意味著在未獲得 crispr/cas9 技術專li授權的商業(yè)機構購買基于 crispr/cas9 技術提供的技術服務和產(chǎn)品，存在著較大的法律風險；其次，很難保證從一家專li所有人購買的專li能覆蓋所有應用需求。
應用 crispr/cas9 技術發(fā)表的文章數(shù)量和質量低于 es 打靶技術發(fā)表的文章
通過 google 學術搜 2013 年至今有關 crispr/cas9 基因敲除和 es 打靶技術有關的文章，搜 knockout「embryonic stem cell」 or「es cell」找到約 17300 條結果，搜 knockout「crispr」or「cas9」找到約 16100 條結果。
針對兩個搜結果，隨機抽檢搜列表中的 100 篇文獻，統(tǒng)計分析后發(fā)現(xiàn)采用 es 打靶技術發(fā)表的文章平均影響因子比 crispr/cas9 技術發(fā)表的文章高 2.1 if。因此，不論從文章質量還是數(shù)量，目前 crispr/cas9 技術的影響力仍弱于金標準的 es 打靶技術。不過不可因此否認 crispr/cas9 技術未來潛在的影響力。
綜合以上幾個方面來看， 近年來一直處于風口浪尖的熱點 crispr/cas9 基因編輯技術已經(jīng)出現(xiàn)過多次類似的 “危機”，雖然有很多優(yōu)勢，但學界仍需對其保持冷靜態(tài)度，隨著不同國家、不同地域的研究者們在 crispr 領域孜孜探，也許這次一系列事件對 crispr 來說并非危機，反而是推動其發(fā)展的重要力量，我們也希望科學家們可以不斷去探，優(yōu)化工藝，以期將基因組編輯技術被更廣泛應用于臨床的疾病治療。