中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準
ny/t 4310-2023
飼料中吡啶甲酸鉻的測定高效液相色譜法
determination of chromium picolinate in feeds-
high performance liquid chromatography
前言
本文件按照gb/t 1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。
請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。
本文件由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜牧獸醫(yī)局提出。
本文件由全國飼料工業(yè)標準化技術(shù)委員會（sac/tc 76）歸口。
本文件起草單位：浙江省獸藥飼料監(jiān)察所。
本文件主要起草人：任玉琴、吳望君、羅成江、侯軒、王彬、裘丞軍、陳曉林、黃娟。
1范圍
本文件描述了飼料中吡啶甲酸鉻的高效液相色譜測定方法。
本文件適用于配合飼料、濃縮飼料、精料補充料和添加劑預混合飼料中吡啶甲酸鉻的測定。
本文件配合飼料、濃縮飼料、精料補充料的檢出限為0.05mg/kg定量限為0.1mg/kg.添加劑預混合飼料的檢出限為0.1 mg/kg、定量限為0.5 mg/kg。
2規(guī)范性引用文件
下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。
gb/t 6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法
gb/t 20195動物飼料試樣的制備
3術(shù)語和定義
本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義
4原理
試樣中的吡啶甲酸鉻用乙腈提取，經(jīng)濃縮凈化后，用高效液相色譜儀測定，外標法定量。
5試劑或材料
除非另有規(guī)定，僅使用分析純試劑。
5.1水：gb/t 6682，一級。
5.2乙腈：色譜純。
5.3甲醇。
5.4 10%乙腈溶液：量取10ml乙腈；加水至100 ml混勻。
5.5乙腈溶液飽和的正己烷：量取正已燒900/ml，加10%乙腈溶液（5.450ml混勻，靜置，取上層溶液。
5.6磷酸鹽緩沖液（ph7.0）：稱取三水合磷酸氫二鉀5.7g、無水磷酸二氫鉀3.4g，加水溶解并定容至1 000 ml，混勻。
5.7標準儲備溶液（250μg/ml）：稱取吡啶甲酸鉻標準品（cas號：14639-25-9，純度≥98.0%）25 mg（精確至0.01 mg），置于100 ml容量瓶中，加乙腈（5.2）超聲溶解，用乙腈定容，混勻。2℃~8℃保存，有效期6個月。
5.8標準中間溶液（25μg/ml）：準確移取標準儲備溶液（5.7）10 ml于100 ml容量瓶中，用水定容，搖勻。臨用現(xiàn)配。
5.9標準系列溶液；準確移取標準中間溶液（5.8）適量，用水定容，配制成濃度分別為0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/m、2.0μg/ml、5.0μg/ml標準系列溶液。臨用現(xiàn)配。
5. 10固相萃取柱：混合型陰離子交換柱，500 mg/6ml。
5.11微孔濾膜：0.45μm，有機系。
6儀器設(shè)備
6.1高效液相色譜儀：配紫外檢測器或二極管陣列檢測器。
6.2分析天平：精度0.01 mg、0.1 mg和1 mg。
6.3離心機：轉(zhuǎn)速不低于8 000 r/min。
6.4氮吹儀。
6.5超聲波清洗器。
6.6渦旋混合器。
7樣品
按（gb/t 20195制備樣品，粉碎使其全部通過0.45mm孔徑的分析篩，充分混勻，裝入磨口瓶中，備用。
8試驗步驟
8.1提取
平行做2份試驗。稱取配合飼料約5 g、濃縮飼料和精料補充料3 g~5 g、添加劑預混合飼料約1 g，精確至0.1mg，置于50ml離心管中，加入乙腈（5.2）25ml，渦旋或超聲（超聲溫度不超過50℃）20 min，8 000 r/min離心10 min，取上清液，置于容量瓶中。殘渣用乙腈（5.2）25 ml重復提取1次，合并2次提取液，用乙腈（5.2）定容至50 ml，混勻。
8.2濃縮、凈化
8.2.1配合飼料、濃縮飼料、精料補充料
準確移取提取液（8.1）5 ml~50 ml（v1，相當于吡啶甲酸鉻0.5μg~50μg），于50℃下用氮氣吹至近干，加5.00 ml 10%乙腈溶液（5.4），超聲或渦旋使溶解，加乙腈溶液飽和的正己烷（5.5）3 ml除脂，渦旋10 s，8 000 r/min離心3 min，取下層清液1.00 ml（v2），加3 ml水，混勻，為試樣溶液a。取固相萃取柱（5.10）依次用5 ml甲醇（5.3）和5 ml水預淋洗，取試樣溶液a全部過柱，用8 ml乙腈（5.2）洗脫，收集洗脫液，于50℃下用氮氣吹至近干，加2.00ml（v3）10%乙腈溶液（5.4）超聲或渦旋使溶解，用0.45μm微孔濾膜（5.11）過濾，濾液為試樣溶液。
8. 2.2添加劑預混合飼料
準確移取提取液（8.1）5ml~50ml（v1，相當于含吡啶甲酸鉻0.25μg~25μg），置于離心管中，于50℃下用氮氣吹至近干，準確加入5ml 10%乙腈溶液（5.4），超聲或渦旋使溶解，8000r/min離心5 min，取上清液用0.45μm微孔濾膜（5.11）過濾，濾液為試樣溶液。
8.3液相色譜參考條件
色譜柱：c18柱，長250 mm，內(nèi)徑4.6 mm，粒徑5μm，或性能相當者；
柱溫：30℃；
檢測波長：264 nm；
流速：0.8 ml/min；
進樣量：50μl；
流動相：a為乙腈（5.2）；b為磷酸鹽緩沖液（5.6），梯度洗脫程序見表1。
8.4測定
8.4.1標準系列溶液和試樣溶液測定
在儀器的最佳條件下，分別取標準系列溶液（5.9）和試樣溶液（8.2.1或8.2.2）上機測定。吡啶甲酸鉻標準溶液的液相色譜圖見附錄a。
8.4.2定性
以保留時間定性，試樣溶液中吡啶甲酸鉻色譜峰的保留時間應(yīng)與標準系列溶液（濃度相當）中吡啶甲酸鉻色譜峰的保留時間一致，其相對偏差應(yīng)在±2.5%。
8.4.3定量
以吡啶甲酸鉻的濃度為橫坐標.色譜峰面積（響應(yīng)值）為縱坐標，繪制標準曲線，其相關(guān)系數(shù)應(yīng)不低于0.99。試樣溶液中吡啶甲酸鉻的濃度應(yīng)在標準曲線的線性范圍內(nèi)。如超出范圍，應(yīng)將試樣溶液用10%乙腈溶液（5.4）稀釋后，重新測定。單點校準定量時，試樣溶液中吡啶甲酸鉻的峰面積與標準溶液中吡啶甲酸鉻的峰面積相差不超過30%。
9試驗數(shù)據(jù)處理
配合飼料、濃飼縮飼料、精料補充料試樣中吡啶甲酸鉻的含量以質(zhì)量分數(shù)ω計，數(shù)值以毫克每千克（mg/kg）表示。多點校準按公式（1）計算，單點校準按公式（2）計算。
式中：
ρ——從標準曲線查得的試樣溶液中吡啶甲酸鉻質(zhì)量濃度的數(shù)值，單位為微克每毫升（μg/ml）；
50——提取液總體積的數(shù)值，單位為毫升（ml）；
5——第一次氨吹后復溶體積的數(shù)值，單位為毫升（ml）；
v1——移取提取液體積的數(shù)值，單位為毫升（ml）；
v2——除脂后移取下層清液體積的數(shù)值，單位為毫升（ml）；
v3——第二次氮吹后復溶體積的數(shù)值，單位為毫升（ml）；
m——試樣質(zhì)量的數(shù)值，單位為克（g）。
a——試樣溶液中吡啶甲酸鉻色譜峰面積；
as——標準溶液中吡啶甲酸鉻色譜峰面積；
cs——標準溶液中吡啶甲酸鉻質(zhì)量濃度的數(shù)值，單位為微克每毫升（μg/ml）；
50——提取液總體積的數(shù)值，單位為毫升（ml）；
5——第一次氮吹后復溶體積的數(shù)值，單位為毫升（ml）；
v1——移取提取液體積的數(shù)值，單位為毫升（ml）；
v2——除脂后移取下層清液體積的數(shù)值，單位為毫升（ml）；
v3——第二次氮吹后復溶體積的數(shù)值，單位為毫升（ml）；
m——試樣質(zhì)量的數(shù)值，單位為克（g）。
添加劑預混合飼料試樣中吡啶甲酸鉻的含量以質(zhì)量分數(shù)ω計，數(shù)值以毫克每千克（mg/kg）表示。多點校準按公式（3）計算，單點校準按公式（4）計算。
式中：
ρ——從標準曲線查得的試樣溶液中吡啶甲酸鉻的質(zhì)量濃度.單位為微克每毫升（μg/ml）；
50——提取液總體積的數(shù)值，單位為毫升（ml）；
5——氮吹后復溶體積的數(shù)值，單位為毫升（ml）；
v1——移取提取液體積的數(shù)值，單位為毫升（ml）；
m——試樣質(zhì)量的數(shù)值，單位為克（g）。
a——試樣溶液中吡啶甲酸鉻色譜峰面積；
as——標準溶液中吡啶甲酸鉻色譜峰面積；
cs——標準溶液中吡啶甲酸鉻質(zhì)量濃度的數(shù)值，單位為微克每毫升（μg/ml）；
50——提取液總體積的數(shù)值。單位為毫升（ml）；
5——氮吹后復溶體積的數(shù)值，單位為毫升（ml）；
v1——移取提取液體積的數(shù)值，單位為毫升（ml）；
m——試樣質(zhì)量的數(shù)值，單位為克（g）。
測定結(jié)果以平行測定的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留3位有效數(shù)字。
10精密度
當吡啶甲酸鉻含量≤05mg/kg時，在重復性條件下，2次獨立測試結(jié)果與算術(shù)平均值的絕對差值不大于該算術(shù)平均值的15%。
當吡啶甲酸鉻含量>0.5mg/kg時，在重復性條件下2次獨立測試結(jié)果與其算術(shù)平均值的絕對差值不大于該算術(shù)平均值的10%。