中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)
農(nóng)業(yè)部1862號(hào)公告-3-2012
飼料中萬古霉素的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法
determination of vancomycin in feeds-
liquid chromatography-tandem mass spectrometry
前言
本標(biāo)準(zhǔn)按照gb/t 1.1給出的規(guī)則起草。
本標(biāo)準(zhǔn)由農(nóng)業(yè)部畜牧業(yè)司提出。
本標(biāo)準(zhǔn)由全國飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(sac/tc 76)歸口。
本標(biāo)準(zhǔn)起草單位；河南省飼料產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站。
本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：班付國、吳寧鵬、彭麗、張發(fā)旺、周紅霞、李慧素。
1范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了飼料中萬古霉素含量測(cè)定的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于配合飼料、濃縮飼料、精料補(bǔ)充料和添加劑預(yù)混合飼料中萬古霉素的測(cè)定。
本標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)限為0.05 mg/kg，定量限為0. 1 mg/kg。
2規(guī)范性引用文件
下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。
gb/t 6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法
gb/t 14699.1飼料采樣
gb/t 20195動(dòng)物飼料試樣的制備
3原理
以0.05 mol/l磷酸鹽緩沖液+乙臘（85+15）提取樣品中的萬古霉素，提取液經(jīng)強(qiáng)陽離子交換固相萃取柱凈化，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行測(cè)定，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線校正，外標(biāo)法定量。
4試劑和材料
除特殊注明外，本法所用試劑均為分析純，水符合gb/t 6682中一級(jí)水的規(guī)定。
4.1鹽酸萬古霉素對(duì)照品：純度≥80.0%。
4.2乙腈：色譜純。
4.3甲醇：色譜純。
4.4甲酸：色譜純。
4.5氨水。
4.6鹽酸。
4.7磷酸二氫鉀。
4.8磷酸。
4.9 0.05mol/l磷酸鹽緩沖液：稱取6.80g磷酸二氫鉀，用水溶解并稀釋至1000ml，用磷酸調(diào)節(jié)ph= 3.20±0.05，即得。
4.10提取液：取磷酸鹽緩沖液850 ml，加乙腈150 ml，混勻，即得。
4.11 0.1%甲酸水溶液：取甲酸1.0 ml加水稀釋至1 000 ml，混勻，即得。
4.12 0.1mol/l鹽酸溶液：取鹽酸9.0ml，加水稀釋至1000ml，混勻，即得。
4. 13 3%氨化甲醇溶液：取氨水3 ml，加入甲醇稀釋至100 ml，混勻，即得。
4.14強(qiáng)陽離子交換固相萃取柱：6 ml，200 mg，粒徑33μm，孔徑8.5 mm；或相當(dāng)者。
4.15標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(1mg/ml)：準(zhǔn)確稱取適量的鹽酸萬古霉素對(duì)照品，用水溶解并定容，配制成1 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。-20℃下保存，有效期為3個(gè)月。
4.16標(biāo)準(zhǔn)工作液(10 ng/ml)：準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用水稀釋成濃度為10μg/ ml的標(biāo)準(zhǔn)工作液。4℃下保存，有效期為1周。
5儀器和設(shè)備
除實(shí)驗(yàn)室常用儀器和設(shè)備外，實(shí)驗(yàn)還需用如下裝置：
a)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(配電噴霧離子源)。
b)分析天平：感量0.01 mg。
c)天平：感量0.01 g。
d)離心機(jī)：可達(dá)8000 r/min(相對(duì)離心力為7012 g)。
e)渦旋混合器。
f)水平振蕩器。
g)超聲清洗器。
h)固相萃取裝置。
i)氮吹儀。
6采樣和試樣制備
按gb/t 14699.1抽取有代表性的飼料樣品，用四分法縮減取約200g。按照gb/t 20195規(guī)定的方法制備樣品，粉碎后過0.45mm孔徑的分析篩，混勻，裝入磨口瓶中，備用。
7測(cè)定步驟
7.1提取
稱取試樣2g(精確至0.01 g)于50 ml離心管中，準(zhǔn)確加入提取液20 ml，渦旋混合后振蕩10min，超聲提取10 min，期間搖動(dòng)2次。取出后，于離心機(jī)上8000 r/min離心5 min，取上清液，備用。
7.2凈化
固相萃取柱依次用甲醇和0.1mol/l鹽酸各3ml活化，準(zhǔn)確移取上清液5ml過柱。用甲醇3ml淋洗，抽干。3%氨化甲醇溶液3ml洗脫，收集洗脫液，于40℃下氮?dú)獯蹈?。?zhǔn)確加入0.1%甲酸水溶液1ml溶解定容，渦動(dòng)混勻，過0.22μm微孔濾膜，上lc-ms/ms測(cè)定。
7.3基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
準(zhǔn)確移取萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，依次加入同類基質(zhì)的空白樣品中，分別制得濃度為50μg/kg、100μg/kg、200μg/kg、400μg/kg、1 000μg/kg、2 000μg/kg的系列空白添加試料。經(jīng)7.1~7.2步驟處理，制得理論濃度為25 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml.500 ng/ml、1 000 ng/ml的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，過濾后上機(jī)測(cè)定。以特征離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。
7.4測(cè)定
7.4.1色譜參考條件
色譜柱：c18柱，柱長100 mm，柱內(nèi)徑2.1 mm，粒度1.7μm；或相當(dāng)?shù)姆治鲋?br>柱溫：40℃。
流動(dòng)相：a相：0.1%甲酸溶液；b相：乙腈。梯度洗脫，梯度見表1。
流速：0.30 ml/min。
進(jìn)樣量：10μl。
7.4.2質(zhì)譜參考條件
離子源：電噴霧離子源。
掃描方式：正離子掃描。
檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)mrm。
電離電壓：3.2 kv。
源溫：110℃。
霧化溫度：400℃。
錐孔氣流速：50 l/h。
霧化氣流速：700 l/h。
定性離子對(duì)、定量離子對(duì)及對(duì)應(yīng)的碰撞能量參考值見表2。
7.4.3定性測(cè)定
萬古霉素選擇1個(gè)母離子和2個(gè)特征離子，在相同試驗(yàn)條件下，樣品中待測(cè)物質(zhì)的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)溶液中對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間偏差在±2.5%之內(nèi)，且樣品中各組分定性離子的相對(duì)豐度與濃度接近的標(biāo)準(zhǔn)溶液中對(duì)應(yīng)的定性離子的相對(duì)豐度進(jìn)行比較，偏差不超過表3規(guī)定的范圍，則可判定為樣品中存在對(duì)應(yīng)的待測(cè)物。
7.4.4定量測(cè)定
在儀器最佳工作條件下，對(duì)基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)、基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液依度為橫坐標(biāo)繪制工作曲線，用單點(diǎn)或多點(diǎn)對(duì)樣品進(jìn)行定量，樣品溶液中待測(cè)物的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器測(cè)定的線性范圍內(nèi)。上述色譜和質(zhì)譜條件下，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液特征離子質(zhì)量色譜圖參見圖a.1。
8結(jié)果計(jì)算和表示
8.1結(jié)果計(jì)算
試樣中萬古霉素含量x以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)，單位為毫克每千克(mg/kg)，按式(1)計(jì)算：
式中：
a——試樣溶液中萬古霉素的峰面積；
as——標(biāo)準(zhǔn)工作液中萬古霉素峰面積；
cs——標(biāo)準(zhǔn)工作液中萬古霉素濃度，單位為微克每毫升(μg/ml)；
v——上機(jī)前最終定容體積，單位為毫升(ml)；
m——樣品的質(zhì)量，單位為克(g)；
v1——提取液中加入spe小柱的體積，單位為毫升(ml)；
v2——總提取液體積，單位為毫升(ml)；
n——稀釋倍數(shù)。
8.2結(jié)果表示
測(cè)定結(jié)果用平行測(cè)定的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。
9重復(fù)性
在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過算術(shù)平均值的20%。