慢病毒是當前zui熱門的基因操作工具，其感染譜廣，可有效地感染腫瘤細胞、神經(jīng)元細胞、心肌細胞、內(nèi)皮細胞、干細胞等多種類型的細胞，從而為基因功能的研究提供了更強有力的工具。然而仍有一部分細胞，尤其是原代細胞和懸浮細胞由于細胞特性，很難獲得的感染效率。為了提高細胞的感染效率，我們常常選擇多加病毒或使用polybrene等助感染試劑，然而細胞狀態(tài)卻變差了，且增加感染效率并沒有達到理解的效果，這是什么原因呢？
一、對慢病毒感染出現(xiàn)的問題進行原因分析
1.細胞狀態(tài)變差——細胞毒性
雜質(zhì)：病毒溶液中殘留的雜質(zhì)蛋白、內(nèi)毒素及宿主細胞dna等是造成細胞毒性的主要因素。特別對于某些外源刺激敏感的細胞來說，嚴重時將導致細胞死亡。這是病毒感染細胞后，狀態(tài)差異的主要原因。過度感染：外源基因過度表達，會導致目的細胞本身正常新陳代謝失衡。這是有些細胞過感會死亡的主要原因。
2.病毒加了不少，效果不理想，如何增加感染效率——了解影響慢病毒感染效率的因素
細胞膜的流動性細胞膜表面受體的表達豐度病毒與細胞的接觸面積和接觸幾率細胞膜與病毒外殼蛋白電荷的多少
二、如何有針對性地增加慢病毒感染效率
了解了影響細胞狀態(tài)和感染效率的原因后，我們就可以有針對性的進行調(diào)整。
1. 使用高滴度高純度的慢病毒，可以減少病毒中的雜質(zhì)對細胞狀態(tài)的影響：降低慢病毒對細胞的毒性
2. 調(diào)整細胞狀態(tài)，感染時使用對數(shù)期的細胞：增加細胞膜的流動性
3. 降低感染時血清濃度，使用無血清/低血清的培養(yǎng)基：降低血清蛋白對病毒外殼蛋白的封閉
4. 離心法，感染時將細胞培養(yǎng)板密封，用平角轉子離心機1000g離心1h，再放回培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)：增加慢病毒與細胞的接觸幾率，但對細胞有一定的機械損傷，儀器要求高
5. 感染時加入rentronectin等纖粘蛋白：增加慢病毒與細胞接觸幾率，但會影響細胞的貼壁狀態(tài)
6. 使用傳統(tǒng)的助感染試劑，如polybrene：中和細胞膜和病毒粒子之間的電荷排斥，但polybrene本身就具有細胞毒性，部分細胞對polybrene敏感，容易導致細胞狀態(tài)變差、形態(tài)發(fā)生變化、甚至死亡。
三、特殊細胞慢病毒感染注意事項
1.懸浮細胞
對于懸浮細胞，可采用離心感染方法提高感染效率。如將細胞培養(yǎng)板密封后，用平角轉子離心機1000g離心1h，再放回培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)。
2.極難感染的細胞
對于極難感染的細胞，可采用多次感染的方法，即感染一次后，重新加入新鮮病毒再次感染，可顯著提升感染效率。但需要注意調(diào)整兩次感染間細胞狀態(tài)。
3.傳代能力較差的原代細胞、非分裂細胞
原代細胞：由于細胞增長緩慢，可以在接種時提高匯合度到50%～60%，確保在感染后4天時細胞匯合度達到90%～100%；
非分裂細胞：如神經(jīng)元細胞，接種后不再增殖，需要按照100%的匯合度進行接種。
q：慢病毒如何稀釋？
a：用常規(guī)培養(yǎng)基、生理鹽水、hanks液、pbs液等將慢病毒稀釋到需要的滴度。如原病毒標記滴度為5 x 108tu/ml，則取20µl病毒液加入到80µl的常規(guī)培養(yǎng)基中，即可得到1 x 108tu/ml的病毒稀釋液。
q：如何確定向細胞中加入慢病毒的*時間？
a：慢病毒感染細胞后需要4天的時間才能觀察到慢病毒攜帶的基因表達，應在細胞匯合度20~40%時且細胞狀態(tài)良好時加入慢病毒，確保在感染后4天時細胞增長達到90%～100%的匯合度。
q：加入慢病毒病毒后，細胞死亡很厲害，該如何處理？
a：這種情況是由于慢病毒對該細胞有一定的毒性作用，需要調(diào)整并降低感染的moi值，并且在感染后4小時、8 小時、12 小時對細胞進行觀察，若發(fā)現(xiàn)細胞狀態(tài)變差時，則需要立刻對細胞進行換液操作，使用新鮮的*培養(yǎng)液替換病毒感染培養(yǎng)液。
q：如何提高慢病毒對細胞的感染效率？
a：慢病毒對細胞的感染效率受多個因素影響，如細胞自身生長的狀態(tài)，細胞數(shù)量，細胞被慢病毒感染的難易程度等。因此保證細胞正常增殖，輪廓清晰，合適的細胞密度，選擇*的感染條件可以更好的保證感染效率。對于懸浮細胞，可采用離心感染方法，減少病毒感染時的體積，從而提高感染效率。如將細胞培養(yǎng)板密封后，用平角轉子離心機1000g離心1h，再放回培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)。